NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 cDNA合成

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ProtoScript® cDNA 第一鏈合成試劑盒含兩種經優(yōu)化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反應混合液。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反轉錄酶和小鼠 RNase 抑制劑，M-MuLV 反應混合液含 dNTP 和經優(yōu)化的緩沖液。該試劑盒還包含兩種優(yōu)化的反轉錄引物和無核酸酶水。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火。經優(yōu)化的隨機引物混合液能隨機并持續(xù)性地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA。合成的第一鏈 cDNA 產物長度可超過 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高純度的完整 RNA 對于靈敏的 RT-PCR 檢測至關重要。RNA 的 A260/A280 比值應至少 1.7 或更高。

總 RNA 或 mRNA 均可用于反轉錄反應。總 RNA 通常足以進行大多數 RT-PCR 分析。不過，如果需要，可以使用 PolyA Spin mRNA 分離試劑盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分離試劑盒（NEB #S1550）獲得 mRNA。

檢測所需的 RNA 量取決于目標轉錄本的豐度。通常推薦使用 1 ng 至 1 μg 的總 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA。

cDNA 第一鏈合成反應
RNA 和引物在 70℃ 條件下變性 5 分鐘，可以去除阻礙較長 cDNA 合成的二級結構。不過，可以在某些情況下省略此步驟（結果未發(fā)表）。

推薦在 42℃ 條件下溫育一小時，以獲得最高產量和最大長度。不過，許多靶標用較短的溫育時間即可進行檢測。例如，對于 2 kb cDNA 合成，溫育 5 分鐘就足夠了。

選擇反轉錄引物
Oligo d(T) 引物是大多數實驗的首·選，因為它確保所有 cDNA 拷貝在 mRNA 的 3′ 端終止并產生最長的連續(xù) cDNA。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火，從而防止在 polyA 尾的內部位點開始退火（1）。不過，如果需要，也可以選擇另外兩種引物。

隨機引物混合液是經優(yōu)化的六聚體和 d(T)23VN 引物混合液。該混合液能隨機地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA（例如核糖體 RNA）。隨機引物混合液產生的 cDNA 平均長度較短，可用于檢測多個短 RT-PCR 產物。隨機引物混合液在各種 RNA 模板中均具有良好的性能。

基因特異引物用于 cDNA 合成反應時，cDNA 產物只能用于擴增該轉錄本。RNA 起始量較低（低于 10 ng）且只需要一種特定的 cDNA 時，使用這種方法可以獲得良好的結果。

推薦的引物濃度：
引物：終濃度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
隨機引物混合液：6 μM
特異引物：0.1–1 μM

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產品應用：
ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit 適用于以下應用領域：

• 定量RT-PCR (qRT-PCR)： 利用高保真cDNA合成結果進行定量基因表達分析。

• 基因克隆： 在克隆實驗中用作RT-PCR的cDNA模板，確保高保真度。

• 基因組學研究： 用于復雜基因組和轉錄組分析，生成高質量的cDNA片段。

• 病毒學研究： 適用于病毒RNA逆轉錄，生成高質量cDNA供后續(xù)分析。

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